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兔波氏杆菌病的实验室诊断

兔波氏杆菌病又称为支气管败血波氏杆菌病，引起兔的一种以慢性鼻炎、支气管肺炎及咽炎为特征的呼吸道传染病。

1　病原学诊断

1.1　细菌培养

样品采集：病兔，将灭菌棉拭子在无菌生理盐水中浸湿，插入病兔鼻腔内，深约10mm，小心转动，蘸取鼻汁；死亡兔或扑杀致死兔，取鼻腔、气管、肺部病变材料用于细菌分离培养。

细菌分离：将附着在棉拭上的黏液涂抹在麦康凯培养基或DHL培养基上，37℃培养48h。肺部病变材料进行培养时，还可用血液琼脂培养基。

结果判定：在改良麦康凯培养基上，支气管败血波氏杆菌菌落直径约1~2mm，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶红色，较大菌落中心厚，呈茶黄色。在DHL琼脂平皿上形成无色半透明，2mm左右菌落。

1.2　病原鉴定

生化试验:不发酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈碱性反应。M.R.试验、靛基质试验、硫化氢产生阴性，V-P试验、枸橼酸盐利用、尿素酶产生、硝酸盐还原、运动力试验阳性。

动物接种试验:常选用幼兔或豚鼠，鼻内接种4h培养物0.1mL，应在几天内出现鼻炎和肺脓肿的典型症状和病理变化。0.5mL剂量耳静脉接种家兔，应于24~48h内死亡。从死亡兔的病变组织及扑杀的活兔的肺脏中均可分离到本菌。

血清平板凝集反应:在清洁的玻片上加一滴阳性血清（约0.3mL），充分混入一铂圈被检菌，轻轻晃动玻片，室温下放置2min。液滴中出现大凝集块或小的粒状凝集物，液体透明，判为阳性。每次试验应设有阴性血清对照和缓冲生理盐水对照。结果判定：液滴中出现大凝集块或小的颗粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

免疫荧光检测抗原:应用直接荧光抗体技术，检查鼻甲骨、气管、细支气管及肺脏上皮细胞，观察到颗粒样抗原者判为阳性。该试验一般在感染后7~28天即可检出抗原。

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2.　血清学诊断

2..1　凝集反应

将Ⅰ相菌接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃培养24~48h，加福尔马林灭活，作为抗原。取凝集抗原与系列稀释的被检血清等量混合，37℃　2h或56℃　30min。4℃作用1夜判定。结果为1∶10被检血清呈现明显颗粒状凝集者判为阳性。家兔在感染后2~4周，即可从血清中测出凝集抗体。

2..2　免疫扩散试验

抗原制备:将Ⅰ相菌接种在含绵羊鲜血的鲍-姜琼脂培养基上，37℃潮湿温箱中培养36h，向生长良好的Ⅰ相菌培养物中加入缓冲生理盐水，充分振荡后，使菌体分散于溶液中而制成悬液，其菌数为2500亿/mL，再添加福尔马林使其含量为0.37%（甲醛0.15%），摇匀，瓶口加盖胶塞，放置37℃温箱（大约18~20h），次日取出，放室温3~5天，每天振荡3次。以500~1000转/min离心沉淀20min，弃上清液；缓冲盐水洗涤沉淀物，12000~15000转/min离心20min，弃上清液；向沉淀加少量缓冲盐水，按万分之一比例加入硫柳防腐。采用辐射免疫扩散法（将其8倍沉淀抗体滴度的抗血清，按10%比例加入到1%琼脂糖Tris缓冲溶液中，制成反应板，然后打孔，室温下湿室作用即可）测定，在反应板上出现直径10mm±1mm明显沉淀者为合格抗原。分装后4℃保存。

阳性血清制造:将上法接种于鲍-姜氏培主基上的Ⅰ相菌用灭菌PBS洗下，记数后加入福尔马林灭活，耳静脉注射3~6月龄的经支气管败血波氏杆菌免疫扩散法检查阴性的健康家兔，每只兔1mL。次菌数为100万/mL，以后每周加强免疫1次，每次菌数递增10倍，计6次。一次注射后4~5天采血，用免疫扩散法测定抗体滴度在8倍以上为合格，第七周自心脏采血，无菌收集血清。

免疫扩散试验配制:0.7%~1.0%的琼脂糖Tris反应板，按试验方法打孔，并在相应孔中加入抗原或血清。室温下湿室中作用，第二天开始判定，逐日观察记录结果，3天后判定。抗原孔与被检血清孔之间形成一条致密的沉淀线并且其末端与毗邻的阳性血清孔与抗原之间的沉淀线相融合者判为阳性，阳性血清与抗原孔之间的沉淀线末端相毗邻的被检血清孔之抗原方向偏弯者亦判为阳性。观察时可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须在强烈的日光灯光源照射下才能看清沉淀线。

采用本法检查时，家兔被支气管败血波氏杆菌感染后7~10天即可检出血清抗体，血清中沉淀抗体的存留期在1年以上。本法与细菌分离的符合率在95%左右。

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 随着免业养殖模式的深度变革，以庭院 式小规模、副业型、低效益的传统养兔逐渐被快速普及推广的规模化饲养、工厂化管理、效益型工厂化养殖所替代。而工厂化养殖的基础条件之一，是必须有较高标准的兔舍和新式(欧式)笼具的配套使用。在最近几年生产和安装实践中，笔者认为新型兔舍和新式笼具配套使用必须遵循以下原则。

1 ; 控温控湿

      传统的庭院式养兔， 一般使用的笼具基本上不具备自动清粪的功能，且繁殖与育肥大部分是分开的，旧房利用和临时搭建的大棚不具备控温条件。现在我们学习和借鉴欧州先进的饲养理念，每栋兔舍每套笼具都同时具备繁殖和育肥的双重功能，兔舍轮换使用，循环清空消毒，实施人工授精，温度控制,灯光照射，药物、集中产仔，定时全进全出，既稳定了正常的生产指标，提高了饲养效率，又通过封闭消毒防控了各类疾病的发生。正因为如此，舍内温变调剂就尤其重要。2013 年，四川金富现代农业有限公司陈红等4位 专家在《温度对家兔的影响及其控制》一文中,对温度对家兔的五大影响(体温、生长、繁殖、疾病、皮毛)都作了详尽的分析，常年舍温的控制值为15-25°C,这就要求我们为了便于控温，在兔舍的选址上就应注意地势高燥平坦、背风向阳、地下水位低、排污方便、远离车来人往和声音嘈杂的交通道口和人群密集区，特别要考虑，冬夏两个季节，在小免密集繁殖产仔时，室内低于8°C的区域,必须配人工增温设施，夏季室内超过28°C,在负压降温的环境中，风机和湿市同时开放的时间自然延长，按照幼免 和成年兔不同时期对温度的适应程度适时调剂, 做到平稳均匀。

2自动清粪
免舍内空气的质量，事关到能否给免群提供- . 个舒适的生存环境，是至关重要的。目前，国内主要是采用水冲、刮板机和地沟配合清粪，有条件的工厂已经开始推广大型履带 式清粪，效果非常明显，舍内没有任何
气味，但是由于一一次性投入成本较高，直接影响到大范围推广，但不论采取那种形式，笼具的设计和安装必须与自动清粪匹配，才能达到净化空气的效果，目前一-部分规模化养殖场的清粪设备、笼具配套还存在不少缺陷。青岛康大食品有限公司的技术总监阎英凯先生在《肉兔工厂化养殖模式》一文中，不但给我们提出了风机和水帘的安装技术要领，同时对笼具的导粪板的倾斜度也提出了严格要求，不管是单层笼、双层笼或三层笼导粪板的倾斜度都必须达到45以 上，保证粪便自然滚落到粪尿沟中或落入履带之上。

3科学布局、综合规划
近几年，凡是具备条件的养兔企业和各类专业合作社，旧舍改造的不是很多，大部分是新场地新规划，新兔舍配套新笼具，切记在规划初期就做到不管新建规模大小或投资批次多少，一定要把集中饲养区、生活办公区、消毒隔离区、粪便排污区、粪便集中处理区同时进行规划。把饲养区内的净道、污道截然分开，风机、水市的安装位置和清粪机安装位置标明清楚，净道 (安装水帘)可以对列在一条通道内，但污道必须分开。因为排风机在工作时，不但是降温，调整兔舍内空气质量的同时也把舍内污浊气体、空中飞毛及室内产生的氨气同时排出。如果这栋兔舍的污浊气体又吹到另-栋兔舍里去了，就前功尽弃了。平时，免舍内除工人和管理人员外，是不允许闲杂人进出的，这就要求我们不但要有制度的保证，更要做到设计之初就把硬件设施同步跟上。
新型笼具配套新型兔舍，以其饲养效益的显著提升，工厂化管理的配套应用，养免产业的必然发展方向，先进养殖理念的具体体现已被越来越多的同业者认可，是大势所趋。胜顺畜牧器材有限公司周经理近几年去过不少地方，在帮助企业设计规划和近几年加工新型笼具的实践经验，浅薄地提出一些自己的见解，供同业者参考，很多不足之处，请专家学者及同行精英修正。

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兔舍

(1)大小
兔舍长度可根据场地条件、家免饲养量以及通风换气、清粪机能力确定，一般控制在50m以内。兔舍跨度一般以兔笼排列多少而进行设计。舍内免笼排列方式为单列，跨度为3m左右;双列兔笼，舍内跨度一-般为4-8m; 3列兔笼，舍内跨度一般为8~12m。 (建子龙《兔舍设计建造中几项关键技术参数研究及某新建兔舍使用效果分析》)兔舍坐北朝南， 东西走向，宽3.5米，长50米，前墙高2.8米，后墙高2.2米。前墙窗户距地面50厘米，规格为3米X1.5米，;后墙同样留有窗户，规格为1米X1.2米。兔舍面积应根据家兔存栏数确定，宽度不应超过5米。大型兔场一般以存入100-150只种兔笼位的面积最为合适。

(2)建筑材料
兔舍屋顶可模仿普通民房，也可用其他材料，关键是能防晒，有保暖性，墙体用砖砌成。地面及出粪道用砖砌好后，水泥抹面。
兔舍四周墙可用砖、石砌成，舍顶可用石板或三合土坯做成，上顶用草苦、草泥，上面用石灰抹平。门可以用工厂下角料花铁叶代替，食槽直径在10-12厘米，可用圆竹筒一劈两半做成。舍底可用竹片或:刨光的木条(宽3-5厘米，长60厘米)钉成或编成，上面涂 上一”层油漆。

（3）兔场 整体布局应依据兔子健康卫生和节省人工为基本原则。最基本的应该是兔场的净道和脏道区分开。人、饲料车等通道不能与运输粪便和死亡兔子的道路共用，场区脏水和雨水分开，减少排污量，污水流向脏道端集中处理排放;整个场区不应该容易积水;兔舍排成一排，一旦超过两排将产生严重的、无法规避的污浊空气、脏净道等交叉污染问题，这对于兔子真菌皮肤病等疾病防控带来严重风险。

(4)形式

兔笼形式按状态、层数及排列方式等可分为平列式、重叠式、阶梯式、立柱式和活动式等5种。目前我国农村养兔以重叠式固定兔笼为主。

①平列式兔笼：兔笼均为单层，一般为竹木或镀锌冷拔钢丝制成，又可分单列活动式和双列活动式两种。主要优点是有利于饲养管理和通风换气，环境舒适，有害气体浓度较低。缺点是饲养密度较低，仅适用于饲养繁殖母兔。

②重叠式兔笼：这类兔笼在长毛兔生产中使用广泛，多采用水泥预制件或砖结构组建而成。一般上下叠放2～4层笼体，层间设承粪板。主要优点是通风采光良好，占地面积小。缺点是清扫粪便困难，有害气体浓度较高。

③阶梯式兔笼：这类兔笼一般由镀锌冷拔钢丝焊接而成，在组装排列时．上下层笼体完全错开，不设承粪板，粪尿直接落在粪沟内。主要优点是饲养密度较大，通风透光良好。缺点是占地面积较大，手工清扫粪便困难。适于机械清粪兔场应用。

④活动式兔笼：一般由竹木或镀锌冷拔钢丝等轻体材料制成，根据构造特点可分为单层活动式，双联单层活动式、单层重叠式、双联重叠式和室外单间移动式等多种。主要优点是移动方便，构造简单，易保持兔笼清洁和控制疾病等。缺点是饲养规模较小，仅适用于家庭小规模饲养。

⑤立柱式免笼: 这类兔笼由长臂立柱架和兔笼组装而成，一般为3层。所有兔笼都置于双向立柱架的长臂上。主要优点是同一-层兔笼的承粪板全部相连，中间无任何阻隔，便于清扫。缺点是由于饲养密度较大，故有害气体浓度较高。

(5)架构         仔母兔笼,兔舍安装,兔舍建造,欧式兔笼,水泥兔笼

①单层兔笼:兔笼在同一水平面排列。这种兔笼饲养密度小，房舍利用率低。但通风通光好，便于管理，环境卫生好。适于饲养繁殖母兔。养兔发达国家和地区(如美国)种兔多采用单层悬挂式兔笼。
②双层免笼:利用固定支架将兔笼上下两个水平面组装排列。较单层兔笼增加了饲养密度，管理方便。
③多层免笼:由三层或更多层笼组装排列。饲养密度大，房舍利用率高，单位肉兔所需房舍的建筑费用小。但层数过多，最上层与最下层的环境条件(如温度、光照)差别较大，操作不方便，通风通光不好，室内卫生难以保持。一般不宜超过三层。
欧美种兔是一层，高度较高，单位空间饲养动物少，动物福利高80-90cm，个人检查兔不会老弯腰;国内大型兔场采用欧美建制，其:他基本是3层(垂直放置、品字放置)。

排污沟
机械清粪主要有三种:常见的牵引式刮粪机、皮带传送式清粪机以及近几年出现的水车式清粪机。水车式清粪机结构和工作原理与牵引式刮机几乎一样，只是用的电动机功率小、污染面小、清粪效果明显。
清粪系统的污染面主要指在刮粪过程中兔的粪尿对兔舍内造成的污染面积，一般主要以粪道底面和粪道侧面的面积为污染面。

(6)通风换气

通风能排出兔舍内的废气和有害气体，提供新鲜空气，有效地减少呼吸道疾病的发病率。一般采用的通风方式有两种: - -种是自然通风，适合于气候环境好和饲养密度小的兔场;另一种是抽气式或送气式的机械通风，这种方式容易控制兔舍内的小气候，尤其对降高温有显著效果。夏天，0.4 m/s左右的风速对家免较适宜。当兔舍外的温度超过家免适应温度时，可采用空气冷却技术进行降温，比较经济的方法是结合通风，在通风处安装喷水装置。
兔舍机械通风方式主要有正压通风和负压通风两种方式。正压通风是指利用风机向封闭兔舍送风，从而使舍内空气压力大于舍外，舍内污浊气体经排气管排出舍外，其优点在于可对进人的空气进行预处理，从而可有效的保证兔舍内的适宜温湿状况和清洁的空气环境。但由于正压通风系统比较复杂、投资和管理费用大，目前国内封闭式兔舍很少采用正压通风方式，而多采用负压通风方式进行调控兔舍环境。负压通风是指利用风机将封闭舍内污浊气体抽出，使舍内压力相对小于舍外，而新鲜空气通过进气口流人舍内从而形成舍内外气体交换。在炎热的夏季，单靠风机并不能有效地降低舍内温度，需要风机与湿帘搭配才能有效地降低舍内温度。湿帘风机降温系统由特种纸质多孔湿帘、水循环系统和低压大流量节能风机以及相关控制装置组成。风机抽风时，造成室内负压，迫使室外未饱和的空气流经湿帘多孔湿润表面，引起水分蒸发吸收大量潜热，从而降低空气自身的温度。

(7)采光
光照对家兔的繁殖有一-定影响。- -般养兔多采用自然光照。兔舍门、窗的采光面积应占地面的15%左右，阳光入射角度不低于25-30°。繁殖母兔每日光照14-16h.可获繁殖效果，并能全年有规律地进行繁殖。公兔需要光照时间较短，一一般每天光照8h。育成兔一-般光照8h以下。对于肥育兔，采用黑暗或微弱照明比强烈光照更为有利。若采用人工光照或补充人工光照，光照强度以每平方米兔舍面积4w照明为宜。

(8)自动喂料及饮水系统
自动喂料系统有行车、角笼以及传送带式喂料系统，在喂料的过程中要以保证采食降低浪费为标准，饮水采用式饮水设备，由减压水箱，控制阀、水管及饮水等组成。当兔口触动饮水时，受到压力影响而使内部弹簧回缩，水即从缝隙流出。这种饮水器的优点是可供肉兔自由饮水，既防污染，又节约用水，但投资成本较高，易造成堵塞和滴漏，另外，要求水质干净。

建议:
风窗的高度太高，需要降低，风窗的高度要和二阶兔笼的高度一一致。在风窗外部连接导气管道，将排除的废气导入有石灰水流动的下水道内，吸收废气。减少了对空气的直接污染。
可以在料槽和水槽里装上感应器，当料和水少于- -定量时，可以自动打开加料装置和加水装置进行加料加水。
兔笼规格可以视兔子体型而定，要尽量保证动物福利，万万不可为了追求节省空间而限制兔子活动。
排污沟设计有些问题，造成兔场污染，味道较大，可以安装自动化输粪设备，减少劳力消耗。

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